進行性假肥大性肌營養不良( Duchenne musculardystrophy,DMD)是一種臨床表現以骨骼肌進行性變性壞死為主的致死性疾病，呈X染色體連鎖隱性遺傳，在男性活嬰中的發病率約為1/3500。

進行性假肥大性肌營養不良遺傳模式

假肥大性肌營養不良的遺傳概率

這種疾病是典型的X性聯隱性遺傳，而且致病基因通常由母親攜帶，但不會發病。而對于后代，如果是男性則顯性發病，成為進行性假肥大性肌營養不良患者;而女性則為終身進行性假肥大性肌營養不良基因的攜帶者。

目前認為，DMD的發病原因主要是抗肌萎縮蛋白結構和功能的異常。該蛋白屬于細胞膜骨架蛋白，由抗肌萎縮蛋白基因編碼，亦為本病的致病基因。患者通常在幼兒或兒童期起病，因肝功能異常進而確診該病;多在成年前因相關肌肉萎縮進一步導致呼吸、心臟衰竭而死亡。

該基因的突變還可引起臨床上癥狀較輕的一種亞型——貝克肌營養不良( Becker muscular dystrophy，BMD)，一般以12歲是否還能夠行走來區分。閱讀框規則可解釋90%的患者基因型與表型關系：即基因突變若導致編碼蛋白提前終止進而產生截短蛋白或產物被降解，則將導致表型嚴重的DMD;未導致框移突變則可產生有部分功能的蛋白，將導致表現為表型較輕的BMD。

假肥大性肌營養不良

迄今為止，針對DMD/BMD仍無有效治療方法。因此，應用簡便、準確的方法檢測致病突變及提供產前診斷或PGD成為預防和減少發病的唯一有效途徑。

由79個外顯子構成的DAD基因是目前人類已知的最大基因，基因組DNA長度約為2.3 Mb，其主要的突變類型是基因外顯子拷貝數異常，以缺失型最為常見，出現異常頻率最高的區域為基因中央區域45～55號外顯子，另一個缺失熱點區位于基因5′端2～20號外顯子。所有患者中，大片段的缺失型占60.9%，重復型占9.1%，單核苷酸改變占20.9%。由于DMD基因突變類型多樣，且突變在不同的家系中具有獨立性，因此必須采用針對性的基因診斷方法和策略。無論是產前診斷還是孕前PGD，對先證者進行基因分析，明確其致病突變是制定孕前PGD實施途徑和策略的前提。

多重連接探針擴增是一種可替代傳統多重PCR方法對DMD患者進行外顯子缺失、重復檢測的技術，由Schouten首先提出。Laing等基于大量DMD患者基因突變分析的結果進行統計，發現當前對DMD/BMD的診斷策略普遍是先對患者進行多重連接探針擴增檢測，然后對未發現突變的患者進行基因組DNA序列分析，最后進行肌組織活檢確定診斷，并獲得抗肌萎縮蛋白mRNA以進行RT-PCR分析DAD基因轉錄。隨著NGS的發展，使同時對DMD基因外顯子拷貝數和點突變講行篩查變得可能。

假肥大性肌營養不良癥狀

由于PGD的受檢材料為單個卵裂球，其DNA含量極少，因此必須先進行DNA擴增。WGA是一組以單個或數個細胞的全部基因組進行非選擇性擴增的技術，目的是通過非傾向性的PCR擴增以指數級別增加DNA的總量。MDA方法是單基因病PGD常用的WGA方法，基本原理是采用多重置換擴增技術對基因組DNA進行穩定擴增。利用隨機6個堿基引物在多個位點與模板DNA退火，并利用Phi29 DNA聚合酶擴增的高效率和高保真性，在DNA的多個位點同時起始復制，以原始DNA模板合成DNA，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又成為新的模板來進行擴增，因此最終可以獲得大量高分子量的DNA，平均長度達10 kb。

DMD的PGD總體策略是盡可能采用直接診斷和間接診斷相結合的方法：首先利用SRY基因及AMEL基因等確定胚胎性別，利用STR和SNP位點確認胚胎是否攜帶致病的等位基因，即間接診斷;之后，針對不同的突變類型，先證者為缺失型患者可利用多重PCR對男性胚胎進行檢測，點突變導致的家系可直接對突變位點進行檢測，即直接診斷。另有10%左右無法檢出突變及重復導致的家系，僅能通過單體型分析的方法進行間接診斷。日本學者Nakabayashi等曾報道采用實時熒光定量PCR方法檢測一個重復型突變家系的PGD，目前國內尚未有類似報道。

DMD基因內部存在9個微衛星位點，分別位于2、7、44、45、49、50、59、63、3′的內含子區域內，為具有不同次數CA堿基重復的STR。一般選擇突變區域上下游可提供信息的STR位點作為連鎖標記進行單體型分析。過去一般使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方式區分雜合的連鎖標記，然而該方法耗時長，且分辨率有限，當同一位置兩個STR位點CA重復次數差距較小時無法判別。因此，可采用熒光標志引物擴增，利用測序儀毛細管電泳的方法進行單體型分析，該方法清晰直觀，可區分重復次數僅相差一次的STR位點，且具有檢測周期短的優勢。

胚胎植入前單倍型分析(PGH)是伴隨NGS技術發展而來的新概念，與傳統的利用STR作為連鎖分析的標志物相比，主要的區別在于其一般選擇突變位點上下游1 Mb以內雜合頻率較高的SNP位點作為連鎖分析的標志物，相較于傳統的PCR+Sanger測序方法，NGS技術在尋找SNP位點方面具有低成本、低耗時的特點。

然而，無論采取何種連鎖分析的方法，都無法回避雙等位基因中某一等位基因隨機性的擴增失敗造成的ADO現象。ADO給單細胞PCR造成了困擾，并極有可能給PGD結果的判讀造成干擾。研究表明，ADO發生率可以高達30%～40%，且單個卵裂球WGA的ADO發生率高于淋巴細胞、極體和成纖維細胞。一般認為SRY基因的脫扣率較為罕見，但Ye等的研究表明，SRY的ADO發生率可能并不像之前預期的那樣。由于ADO現象無法避免，因此采用盡可能多的位點進行判別是克服ADO干擾的有效方法。

由于存在ADO或交換，將無可避免地導致PGD存在一定的診斷錯誤率。因此，建議所有通過PGD成功妊娠的孕婦，均應該在妊娠中期接受羊膜腔穿刺，對胎兒進行產前基因檢測，以防止因PGD診斷錯誤導致的異常嬰兒出生。