進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良( Duchenne musculardystrophy,DMD)是一種臨床表現(xiàn)以骨骼肌進(jìn)行性變性壞死為主的致死性疾病，呈X染色體連鎖隱性遺傳，在男性活嬰中的發(fā)病率約為1/3500。

進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良遺傳模式

假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良的遺傳概率

這種疾病是典型的X性聯(lián)隱性遺傳，而且致病基因通常由母親攜帶，但不會(huì)發(fā)病。而對(duì)于后代，如果是男性則顯性發(fā)病，成為進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良患者;而女性則為終身進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的攜帶者。

目前認(rèn)為，DMD的發(fā)病原因主要是抗肌萎縮蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常。該蛋白屬于細(xì)胞膜骨架蛋白，由抗肌萎縮蛋白基因編碼，亦為本病的致病基因?；颊咄ǔＴ谟變夯騼和谄鸩?，因肝功能異常進(jìn)而確診該病;多在成年前因相關(guān)肌肉萎縮進(jìn)一步導(dǎo)致呼吸、心臟衰竭而死亡。

該基因的突變還可引起臨床上癥狀較輕的一種亞型——貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良( Becker muscular dystrophy，BMD)，一般以12歲是否還能夠行走來(lái)區(qū)分。閱讀框規(guī)則可解釋90%的患者基因型與表型關(guān)系：即基因突變?nèi)魧?dǎo)致編碼蛋白提前終止進(jìn)而產(chǎn)生截短蛋白或產(chǎn)物被降解，則將導(dǎo)致表型嚴(yán)重的DMD;未導(dǎo)致框移突變則可產(chǎn)生有部分功能的蛋白，將導(dǎo)致表現(xiàn)為表型較輕的BMD。

假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良

迄今為止，針對(duì)DMD/BMD仍無(wú)有效治療方法。因此，應(yīng)用簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法檢測(cè)致病突變及提供產(chǎn)前診斷或PGD成為預(yù)防和減少發(fā)病的唯一有效途徑。

由79個(gè)外顯子構(gòu)成的DAD基因是目前人類(lèi)已知的最大基因，基因組DNA長(zhǎng)度約為2.3 Mb，其主要的突變類(lèi)型是基因外顯子拷貝數(shù)異常，以缺失型最為常見(jiàn)，出現(xiàn)異常頻率最高的區(qū)域?yàn)榛蛑醒雲(yún)^(qū)域45～55號(hào)外顯子，另一個(gè)缺失熱點(diǎn)區(qū)位于基因5′端2～20號(hào)外顯子。所有患者中，大片段的缺失型占60.9%，重復(fù)型占9.1%，單核苷酸改變占20.9%。由于DMD基因突變類(lèi)型多樣，且突變?cè)诓煌募蚁抵芯哂歇?dú)立性，因此必須采用針對(duì)性的基因診斷方法和策略。無(wú)論是產(chǎn)前診斷還是孕前PGD，對(duì)先證者進(jìn)行基因分析，明確其致病突變是制定孕前PGD實(shí)施途徑和策略的前提。

多重連接探針擴(kuò)增是一種可替代傳統(tǒng)多重PCR方法對(duì)DMD患者進(jìn)行外顯子缺失、重復(fù)檢測(cè)的技術(shù)，由Schouten首先提出。Laing等基于大量DMD患者基因突變分析的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前對(duì)DMD/BMD的診斷策略普遍是先對(duì)患者進(jìn)行多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)，然后對(duì)未發(fā)現(xiàn)突變的患者進(jìn)行基因組DNA序列分析，最后進(jìn)行肌組織活檢確定診斷，并獲得抗肌萎縮蛋白mRNA以進(jìn)行RT-PCR分析DAD基因轉(zhuǎn)錄。隨著NGS的發(fā)展，使同時(shí)對(duì)DMD基因外顯子拷貝數(shù)和點(diǎn)突變講行篩查變得可能。

假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥狀

由于PGD的受檢材料為單個(gè)卵裂球，其DNA含量極少，因此必須先進(jìn)行DNA擴(kuò)增。WGA是一組以單個(gè)或數(shù)個(gè)細(xì)胞的全部基因組進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，目的是通過(guò)非傾向性的PCR擴(kuò)增以指數(shù)級(jí)別增加DNA的總量。MDA方法是單基因病PGD常用的WGA方法，基本原理是采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)對(duì)基因組DNA進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增。利用隨機(jī)6個(gè)堿基引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA退火，并利用Phi29 DNA聚合酶擴(kuò)增的高效率和高保真性，在DNA的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)起始復(fù)制，以原始DNA模板合成DNA，同時(shí)取代模板的互補(bǔ)鏈。被置換的互補(bǔ)鏈又成為新的模板來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，因此最終可以獲得大量高分子量的DNA，平均長(zhǎng)度達(dá)10 kb。

DMD的PGD總體策略是盡可能采用直接診斷和間接診斷相結(jié)合的方法：首先利用SRY基因及AMEL基因等確定胚胎性別，利用STR和SNP位點(diǎn)確認(rèn)胚胎是否攜帶致病的等位基因，即間接診斷;之后，針對(duì)不同的突變類(lèi)型，先證者為缺失型患者可利用多重PCR對(duì)男性胚胎進(jìn)行檢測(cè)，點(diǎn)突變導(dǎo)致的家系可直接對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，即直接診斷。另有10%左右無(wú)法檢出突變及重復(fù)導(dǎo)致的家系，僅能通過(guò)單體型分析的方法進(jìn)行間接診斷。日本學(xué)者Nakabayashi等曾報(bào)道采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)一個(gè)重復(fù)型突變家系的PGD，目前國(guó)內(nèi)尚未有類(lèi)似報(bào)道。

DMD基因內(nèi)部存在9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分別位于2、7、44、45、49、50、59、63、3′的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，為具有不同次數(shù)CA堿基重復(fù)的STR。一般選擇突變區(qū)域上下游可提供信息的STR位點(diǎn)作為連鎖標(biāo)記進(jìn)行單體型分析。過(guò)去一般使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方式區(qū)分雜合的連鎖標(biāo)記，然而該方法耗時(shí)長(zhǎng)，且分辨率有限，當(dāng)同一位置兩個(gè)STR位點(diǎn)CA重復(fù)次數(shù)差距較小時(shí)無(wú)法判別。因此，可采用熒光標(biāo)志引物擴(kuò)增，利用測(cè)序儀毛細(xì)管電泳的方法進(jìn)行單體型分析，該方法清晰直觀，可區(qū)分重復(fù)次數(shù)僅相差一次的STR位點(diǎn)，且具有檢測(cè)周期短的優(yōu)勢(shì)。

胚胎植入前單倍型分析(PGH)是伴隨NGS技術(shù)發(fā)展而來(lái)的新概念，與傳統(tǒng)的利用STR作為連鎖分析的標(biāo)志物相比，主要的區(qū)別在于其一般選擇突變位點(diǎn)上下游1 Mb以內(nèi)雜合頻率較高的SNP位點(diǎn)作為連鎖分析的標(biāo)志物，相較于傳統(tǒng)的PCR+Sanger測(cè)序方法，NGS技術(shù)在尋找SNP位點(diǎn)方面具有低成本、低耗時(shí)的特點(diǎn)。

然而，無(wú)論采取何種連鎖分析的方法，都無(wú)法回避雙等位基因中某一等位基因隨機(jī)性的擴(kuò)增失敗造成的ADO現(xiàn)象。ADO給單細(xì)胞PCR造成了困擾，并極有可能給PGD結(jié)果的判讀造成干擾。研究表明，ADO發(fā)生率可以高達(dá)30%～40%，且單個(gè)卵裂球WGA的ADO發(fā)生率高于淋巴細(xì)胞、極體和成纖維細(xì)胞。一般認(rèn)為SRY基因的脫扣率較為罕見(jiàn)，但Ye等的研究表明，SRY的ADO發(fā)生率可能并不像之前預(yù)期的那樣。由于ADO現(xiàn)象無(wú)法避免，因此采用盡可能多的位點(diǎn)進(jìn)行判別是克服ADO干擾的有效方法。

由于存在ADO或交換，將無(wú)可避免地導(dǎo)致PGD存在一定的診斷錯(cuò)誤率。因此，建議所有通過(guò)PGD成功妊娠的孕婦，均應(yīng)該在妊娠中期接受羊膜腔穿刺，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因檢測(cè)，以防止因PGD診斷錯(cuò)誤導(dǎo)致的異常嬰兒出生。